ICS11.030.30
CCS C30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1950—2024
组织工程医疗器械 丝素蛋白
Tissueengineeringmedicaldevice—Silkfibroin
2024-09-29发布2025-10-15实施
国家药品监督管理局发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 分类……………………………………………………………………………………………………… 2
5 动物源性材料要求……………………………………………………………………………………… 2
6 性能要求………………………………………………………………………………………………… 2
7 试验方法………………………………………………………………………………………………… 4
8 稳定性…………………………………………………………………………………………………… 6
9 包装、运输和贮存………………………………………………………………………………………… 6
附录A(资料性) 丝素蛋白基本结构特性及制备方法研究进展……………………………………… 7
附录B(规范性) 再生丝素蛋白分子量测定———流变学方法…………………………………………… 9
参考文献…………………………………………………………………………………………………… 14
Ⅰ
YY/T1950—2024
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会
(SAC/TC110/SC3)归口。
本文件起草单位:浙江大学、中国食品药品检定研究院、复旦大学、浙江星月生物科技股份有限公
司、复向丝泰医疗科技(苏州)有限公司、江西丝科生物科技有限公司。
本文件主要起草人:欧阳宏伟、徐丽明、邵正中、赵洪石、刘也卓、柳克银、刘振齐、汪燕艳、陈新、
杨文华、杨涛、刘丽。
Ⅲ
YY/T1950—2024
引 言
本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及附录B流变学方法测定分子质量的方
法和数据拟合计算相关专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。
该专利持有人已向本文件的发布机构承诺,附录B已经公开给出了方法操作说明,专利持有人愿
意同任何标准使用人在合理且无歧视的条款和条件下共享该方法的应用。该专利持有人的声明已经在
本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得。
专利持有人姓名:复旦大学
地址:上海市邯郸路220号
请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利
责任。
Ⅳ
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组织工程医疗器械 丝素蛋白
1 范围
本文件规定了用于组织工程医疗器械产品的丝素蛋白的性能要求,以及标志、包装、运输和贮存等
要求,并描述了相应的试验方法。
本文件适用于制备组织工程医疗器械产品的丝素蛋白。
注1:本文件所指的丝素蛋白,是以天然桑蚕的茧层或生丝为原料,经过脱丝胶处理得到的产物(即天然丝素蛋白纤
维)或脱胶后溶解再生等工艺处理后得到的产物(即再生丝素蛋白)。不包括经基因工程或转基因获得的丝素
蛋白。
注2:其他外科植入物或敷料类等产品所用的丝素蛋白参考本文件。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T16886(所有部分) 医疗器械生物学评价
GB/T32016 蚕丝 氨基酸的测定
FZ/T40006 蚕丝含油率试验方法
SN/T2843 生丝含胶率的测定方法
YY/T0771.1 动物源医疗器械 第1部分:风险管理应用
YY/T0771.2 动物源医疗器械 第2部分:来源、收集与处置的控制
YY/T0771.3 动物源医疗器械 第3部分:病毒和传播性海绵状脑病(TSE)因子去除与灭活的
确认
YY/T1465(所有部分) 医疗器械免疫原性评价方法
中华人民共和国药典 2020年版
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
丝素蛋白 silkfibroin
由桑蚕后部丝腺合成分泌的纤维状蚕丝蛋白。
注:桑蚕丝纤维中的核心蛋白质由理论分子质量约为391kDa的重链(H 链蛋白)、25kDa的轻链(L链蛋白)和30
kDa或27kDa的P25(也称为纤维六聚体)组成,H 链蛋白、L链蛋白和P25蛋白的物质的量比是6∶6∶1。重
链和轻链通过单个二硫键连接,P25为含有天冬酰胺(ASN)寡糖链的糖蛋白,P25与二硫键连接的重链和轻链
通过疏水键等非共价键作用结合。
3.2
再生丝素蛋白 regeneratedsilkfibroin;RSF
再生丝蛋白
蚕丝核心纤维(丝素蛋白纤维)溶解除盐后的蛋白质混合物。
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注1:其基本的氨基酸基序(motif)与丝素蛋白相同。再生丝蛋白在脱胶和溶解过程导致其分子链无序降解,分子
质量下降至不低于10kDa,且分子链的构效关系与丝素蛋白纤维中的构效关系存在较大差别,通常以微黄色
半透明的水溶液的形式存在。按成型和干燥方法的不同,也能制成水溶性(聚集态结构主要为Silk Ⅰ)和水
不溶性(聚集态结构主要为SilkⅡ)的白色粉末。
注2:制法为天然蚕(茧)丝纤维脱除丝胶蛋白后,在高浓度盐,如,溴化锂、硫氰酸钠、尿素、硝酸钠或氯化钙-乙醇等
的水溶液中充分溶解,再以透析等方式除盐,制成各种不同性状的材料。
3.3
丝胶 sericin
由蚕中部丝腺合成分泌的球状蛋白质混合物。
注:蚕吐丝结茧时,丝胶被覆于由丝素蛋白形成的核心纤维表面,主要起黏结作用以利于核心纤维成茧。其分子质
量在250kDa~400kDa之间,具有水溶性,能在脱胶过程中完全除去。
3.4
生丝 rawsilk
以桑蚕茧为原料,按一定的制丝工艺和质量要求,用机械方式将若干根茧丝抱合胶着缫制而成的
长丝。
[来源:GB/T26380—2022,3.2.6]
3.5
茧层 cocoonlayer
蚕吐丝形成的蚕茧,主要由蚕丝纤维核心蛋白质(70%~80%)和丝胶蛋白(20%~30%)组成。
注:俗称茧壳。
4 分类
根据制备工艺,分为脱胶处理的天然丝素蛋白纤维和脱胶后再行溶解(或从后丝腺中直接提取纯
化)的再生丝素蛋白。
5 动物源性材料要求
用于制作丝素蛋白的桑蚕生丝或桑蚕茧层应按照YY/T0771.1、YY/T0771.2、YY/T0771.3进行
管理和控制,包括桑蚕品系、地理来源、饲养过程等因素。
6 性能要求
6.1 性状
脱丝胶处理的天然丝素蛋白纤维为白色或淡黄色固体。再生丝素蛋白可形成白色或淡黄色或无色
固体(纤维、粉末,或海绵、膜、块材等)、溶液或水凝胶等,无异味。
6.2 分子质量
再生丝素蛋白分子质量分布在10kDa~400kDa之间,应在标识范围内。
6.3 结构表征
6.3.1 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)
丝素蛋白的FT-IR 实测谱带应在1700cm-1 ~1600cm-1、1590cm-1 ~1460cm-1,以及
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1280cm-1~1190cm-1处存在特征峰,分别对应丝素蛋白的酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带以及酰胺Ⅲ带。
6.3.2 高级结构
丝素蛋白的聚集态结构有结晶态和无定形态两类。结晶态有两种空间构型,分别称为α型和β 型,又称SilkⅠ和Silk Ⅱ。X 射线衍射(XRD)实测图谱在2θ=20°~21°为丝素蛋白Silk Ⅱ结晶结
构,2θ=24°~27°的峰为丝素蛋白SilkⅠ结晶结构。拉曼光谱实测谱带一般在1672cm-1~1645cm-1、
1448cm-1~1439cm-1、1280cm-1~1228cm-1分别对应丝素蛋白的酰胺Ⅰ特征峰、酰胺Ⅱ特征峰
和酰胺Ⅲ特征峰。
6.4 蛋白质含量
应≥96%(质量分数,干重)。
6.5 总氨基酸及主要氨基酸含量分析
总氨基酸含量应大于95%(质量分数,干重),其中特征氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸总含量应不
小于76%(质量分数)。
6.6 丝胶残留
脱胶后蚕丝纤维的丝胶残留应≤2%(质量分数,干重)。
注:本项指标针对脱胶处理后丝素蛋白纤维,也针对再生丝素蛋白脱胶工艺的控制指标。
6.7 脂类物质残留量
丝素蛋白中的脂类物质主要为蜡质和其他油脂类物质,其残留量应≤0.5%(质量分数,干重)。
6.8 pH
应为5.0~8.0。
6.9 重金属含量
重金属总含量(以Pb计)应≤10μg/g(质量分数)。
砷含量≤1μg/g(质量分数);铬、镉、铜、铁、汞、镍、铅、钼总量应≤50μg/g(质量分数)。
6.10 干燥失重
应≤11%(质量分数,干重)。
注:本项目仅针对固态的丝素蛋白。
6.11 炽灼残渣
应≤1.5%(质量分数,干重)。
6.12 试剂残留
6.12.1 概述
应对工艺中使用的试剂(如,溴化锂、尿素、硼砂、硼酸、氯化钙等)进行残留量检测,并根据其潜在风
险进行限量控制。
6.12.2 溴化锂残留量
若使用溴化锂溶解丝素蛋白纤维,制备再生丝素蛋白,则干重下单位质量溴离子含量应≤80mg/g,锂
离子含量应≤2mg/g。
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6.12.3 环氧乙烷(EO)残留
若采用环氧乙烷灭菌,应按照GB/T16886.7中的规定,对灭菌后产品中环氧乙烷残留进行检
测,残留量应≤10μg/g。
6.13 细菌内毒素含量
应≤0.05EU/mg(干重)。
6.14 无菌试验
应无菌。
注:如果丝素蛋白以无菌方式提供,需进行该项目的检测,并按照GB18278.1、GB18279.1、GB18280.1进行灭菌工
艺确认。
6.15 微生物限度
每克(g)供试品中需氧菌总数应<100CFU,霉菌和酵母菌菌落数应<20CFU,不应检出金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。
注:如果丝素蛋白以非无菌的方式提供,则进行该项目的检测。
6.16 生物学评价
6.16.1 作为制备医疗器械产品的原(材)料,应按照GB/T16886.1的要求对丝素蛋白进行相应的生物
学评价。
6.16.2 丝素蛋白是人体中不存在的蛋白质,宜根据其预期的使用目的(适用时),对其可能的免疫原性
和对人体的潜在免疫毒理学风险进行充分评价。
7 试验方法
7.1 性状
通过鼻嗅和肉眼直接观测。
7.2 分子质量
7.2.1 电泳法
固体样品需用纯化水或9.3mol/L溴化锂溶液溶解,制成1mg/mL溶液,液体样品使用纯化水稀
释至1mg/mL作为供试液,按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0541电泳法,第五法SDS聚
丙烯酰胺凝胶电泳法的规定进行检验,给出最低分子质量。
注:若测试条带出现偏离或不在同一直线上,需用蛋白质快速脱盐柱对供试液进行脱盐处理。
7.2.2 流变学法
按照附录B,采用流变学方法测试供试品的平均分子质量。
注:若再生丝素蛋白分子质量较低,使用电泳法给出分子质量下限或/和上限(分子质量分布)。
7.3 结构表征
7.3.1 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)
将丝素蛋白干燥至恒重,按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0402 红外分光光度法规
定的衰减全反射方法测定。
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7.3.2 高级结构
参考《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0421拉曼光谱法或《中华人民共和国药典》2020年版
四部通则0451X射线衍射法对供试品进行检测。
7.4 蛋白质含量
按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0731 蛋白质含量测定法中规定的第一法凯氏定
氮方法测定法(2)测定。
注:除另有规定外,换算系数通常按6.25计算。建议企业结合自身原料和产品的氨基酸分析结果,计算换算系
数,完成验证,并在检验报告中注明。
7.5 总氨基酸及主要氨基酸含量分析
按照GB/T32016中酸水解法对丝素蛋白样品进行预处理,使用氨基酸分析仪进行氨基酸含量的
测定,并计算丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸的总含量。
7.6 丝胶残留
根据SN/T2843中规定的方法测定。
注:高温碱液会在一定程度上破坏丝素蛋白纤维,且不同脱胶条件制备的丝素蛋白纤维对于高温碱液的耐受能力
可能各不相同,从而引起检验过程中丝素蛋白的质量损失,导致检验结果偏高。建议企业结合自身原料和脱胶
工艺分析该方法的适用性,必要时减少检验方法中的煮炼次数,但需要进行相关方法学验证。
7.7 脂类物质含量
按照FZ/T40006中规定的方法测试。
也可参考GB5009.6—2016中第二法酸水解法规定的方法进行测试,选择该方法检验应先进行方
法验证。
7.8 pH
丝素蛋白溶液直接使用pH 计检测,固体丝素蛋白样品使用浸提液检测。按照GB/T16886.12的
规定制备浸提液。取浸提液或丝素蛋白溶液,按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0631pH
测定法的规定检测。
7.9 重金属含量
重金属总含量按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0821重金属检查法第二法的规定进
行检测;铬、镉、铜、铁、镍、铅、钼、砷、汞的含量按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0406 原
子吸收分光光度法,或0411电感耦合等离子体原子发射光谱法,或0412电感耦合等离子体质谱法规定
进行检测。
7.10 干燥失重
按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0831干燥失重测定法规定。
7.11 炽灼残渣
取一定质量的样品,按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0832 水分测定法,第二法(烘
干法)规定的方法干燥并精密称重。按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0841 炽灼残渣检
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查法规定的方法进行检测。
7.12 试剂残留
7.12.1 按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0513 离子色谱法或《中华人民共和国药典》
2020年版四部通则0412电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)的规定检测溴离子和锂离子残留量。
7.12.2 按照GB/T16886.7中规定的方法检验环氧乙烷残留量。
7.13 细菌内毒素含量
按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1143细菌内毒素检查法的规定进行检测。
7.14 无菌试验
按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1101无菌检查法的规定进行检测。
7.15 微生物限度
按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法
的规定进行检测。
7.16 生物学评价
7.16.1 按照GB/T16886(所有部分)进行相应的生物学评价。
注:按照GB/T16886.12规定的试验样品处理方法对试验样品进行处理时,如果产品以非无菌的方式提供,如对试
验程序适用,试验样品需按制造商推荐的灭菌方法灭菌并无菌操作。
7.16.2 按照GB/T16886.20和YY/T1465(所有部分)进行必要的免疫原性和免疫毒理学评价。
7.16.3 材料的细胞生物学效应评价
宜选择与预期用途相适应的细胞,进行材料的细胞生物学效应评价,如细胞在材料上黏附、增殖
和/或迁移等。
8 稳定性
在规定贮存条件下进行稳定性研究。如样品采用灭菌工艺,应研究灭菌方法对样品性能和稳定性
的影响。
9 包装、运输和贮存
9.1 若生产商作为本单位研发医疗器械产品的初始材料(原材料)时,应按照医疗器械生产中对原材料
管理的质量体系进行包装、运输、贮存相关管理。
9.2 若生产商作为医疗器械研发的原材料销售时,宜参照医疗器械产品对包装、运输、贮存的要求,提
供必要的信息。应采用适宜的包装,确保丝素蛋白产品的安全性和有效性。
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附 录 A
(资料性)
丝素蛋白基本结构特性及制备方法研究进展
A.1 丝素蛋白的基本结构特性
天然丝素蛋白是由桑蚕后部丝腺合成分泌的纤维状蚕丝蛋白。天然桑蚕丝纤维中的核心蛋白质由
理论分子质量约为391kDa的重链(H-chain)、25kDa的轻链(L-chain)和30kDa或27kDa的P25(也
称为纤维六聚体)组成,H 链蛋白、L链蛋白和P25蛋白的物质的量比是6∶6∶1。重链和轻链通过单
个二硫键连接,P25为含有ASN 寡糖链的糖蛋白,P25与二硫键连接的重链和轻链通过疏水键等非共
价键作用结合。
桑蚕丝素蛋白的氨基酸主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。丝素蛋白重链由12个重复序列(domains)
组成,这些重复序列形成了丝素蛋白纤维的结晶区,这些重复序列与非重复的一级序列相互交
错,从而在纤维中形成较少的有序区域。纤维结晶区为甘氨酸-X 重复序列,X 为丙氨酸、丝氨酸、苏氨
酸和缬氨酸。结晶区平均由381个氨基酸残基组成(第7重复序列含596个氨基酸残基,第12重复序
列含36 个氨基酸残基)。每个重复序列都包含六肽或八肽的子重复序列,包括:GAGAGS、
GAGAGAGY或GAGAGA 等。这些子重复序列末端与GAAS或GAGS四肽序列连接。非结晶区即
晶区的连接部分,长度为42个~44个氨基酸残基。所有的非结晶区都有一个相同的25个氨基酸残基
(非重复序列),它是由结晶区中没有的带电氨基酸组成的。丝素蛋白的一级序列结构具有天然的共嵌
段聚合物结构特征。
桑蚕丝素蛋白的分子链构象包括无规卷曲、β-折叠、β-转角,以反向平行β-折叠为基础。天然桑蚕
丝纤维中β-折叠构象的含量很高,且β-折叠的取向是沿着纤维轴高度取向,这赋予蚕丝纤维优良的力
学性能。另外,蚕丝纤维中结晶区和非结晶区两部分交替分布,受应力作用时非结晶区可吸收大部分的
能量,从而使蚕丝具有较好的韧性。
丝素蛋白可形成具有多种晶型的凝聚态结构,包括结晶前的腺体状态(SilkⅠ)、由β-折叠二级结构
组成的绢丝状态(SilkⅡ)和空气/水组装界面丝(SilkⅢ,具有螺旋结构)。其中,Silk Ⅰ结构为水溶性
状态,在丝素蛋白的溶液中,大分子链间一般以无规线团及少量的螺旋结构为主。其在受热或物理旋转
时容易转变为β-折叠结构为主的SilkⅡ结构,例如通过调节溶液中金属离子与氧化物交联剂的浓度、
或改变pH、温度、电场等条件。β-折叠结构是不对称的,一侧被甘氨酸的氢侧链占据,另一侧被疏水区
丙氨酸的甲基侧链占据。β-折叠有序排列,使得甲基基团和β-折叠中的氢键形成晶体中折叠间堆叠,通
过氢键和范德华力产生热稳定结构;同时,垂直于β-折叠方向的氨基酸之间形成链内或链间氢键,可影
响丝素蛋白基材料的力学性能。
A.2 丝素蛋白材料的制备方法
丝素蛋白可从桑蚕体内后部丝腺中直接提取,或通过脱胶并溶解和透析等处理从桑蚕丝中提取。
常用的提取方法如下。
a) 桑蚕丝腺中直接提取:蚕到五龄末期丝腺内腔充满液状无规线团的丝物质,后部丝腺分泌的丝
素是非结晶化的α型丝素溶胶。在蚕达到五龄后6d~8d时(吐丝结茧前)进行解剖,取出后
部丝腺,浸泡于预冷的注射用水中(约4℃),摇床处理7h~8h,过滤去除杂质,得到丝素蛋白
水溶液。
b) 蚕丝脱胶:一般可使用碱性试剂脱胶(如碳酸钠、碳酸氢钠、尿素等)、酸性试剂脱胶(酒石酸、
柠檬酸等有机酸)、中性皂液脱胶、高温高压水脱胶、酶法脱胶(如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等)。
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其中使用碳酸钠脱胶是目前最常用的脱胶方法,其对丝胶的溶解作用强,脱胶效率高。有机酸
脱胶较少使用;中性皂液脱胶较温和,丝胶残留较多;高温高压水脱胶对丝素纤维的力学性能
影响较大;酶法脱胶是利用酶作用于丝胶蛋白主链上的特定氨基酸位点,催化肽键水解,从而
将蚕丝外围的丝胶蛋白除去,该方法脱胶效果较碳酸钠脱胶弱,长时间浸泡在酶溶液中,丝素
蛋白表面会被逐渐腐蚀/降解。总之,采用不同脱胶程序/试剂,均能有效地除去丝胶蛋白,但
其对丝纤维的表面形貌、所获丝素蛋白的分子质量以及丝素蛋白基材料的力学性能等也有很
大的影响。
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附 录 B
(规范性)
再生丝素蛋白分子量测定———流变学方法
B.1 原理
本方法通过确定样品的储能模量(G')和损耗模量(G″)与拟合理论数值的偏离量来测定丝素蛋白
的数均分子质量和重均分子质量。
在丝素蛋白离子液体溶液的稳态流变行为中表现出典型的高分子溶液行为,即在不同浓度的测试
范围内,丝素蛋白浓度越大,溶液黏度越大;并且高浓度再生溶液的黏度值与腺体中天然丝素蛋白溶胶
的黏度值在数量级上是很接近的。在不同浓度下,溶液黏度的剪切速率依赖性呈现几种不同的趋
势,即,1)低剪切速率下的剪切变稀行为;2)中等剪切速率下的牛顿流体行为;3)高剪切速率下的剪切变
稀行为。高浓度溶液(浓度>7%,质量分数)则随着剪切速率的增大,流动曲线直接由低剪切区域的牛
顿流体平台紧接着进入高剪切区域的剪切变稀状态,这种剪切变稀行为与传统的高分子溶液非常相似。
在Flory-Huggins高分子溶液理论中,Huggins参数K H 能够反映高分子与溶剂混合时相互作用
能的变化,一般来说K H<0.5时,高分子链在稀溶液下能够舒展,可判断该溶剂为高分子的良溶剂。通
过计算Huggins参数,可以定量地确定丝素蛋白在离子液体溶液中的状态。在既往的研究中,所测得
丝素蛋白在离子液体(1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐,AmimCl)溶液的Huggins参数K H <0.1,说明该离
子液体是丝素蛋白分子的良溶剂,意味着丝素蛋白在该溶剂中呈现单链状态。
高分子浓溶液除了表现出黏性液体的特性,同时也具有弹性固体的特性,这种兼有的特性即为高分
子溶液的黏弹性。高分子浓溶液中,高分子链伸展并相互贯穿、相互缠结,形成拓扑缠结网。该缠结行
为所表现出的性质又能够反映出高分子链的结构、组成等信息。动态力学法是研究高分子黏弹性的方
法之一。对于高分子溶液来说,流变学方法中的动态剪切法可以测量高分子溶液的黏弹性。其原理是
流变仪的平板对高分子溶液施加交变的应变,同时测定其应力的变化。当达到平衡时,应力和应变两者
都按正弦函数形式变化。
在由蚕丝经历脱胶和溶解两步骤获取再生丝素蛋白溶液的过程中,必然会引起再生丝素蛋白分子
链的无序降解,从而致使丝素蛋白由天然腺体中的单一明确分子质量转变为多分布的分子质量。
Rouse模型描述了溶液模量与高分子溶质的浓度及分子质量的关系,因此通过模型对试验测量的数据
进行拟合,就可获得体系中再生丝素蛋白的分子质量。
对于高分子分子质量多分散体系,溶液的动态模量不仅与高分子溶质的平均分子尺寸(分子质量)
有关,还与不同分子尺寸的高分子溶质所占的比例有关。换言之,多分散体系的分子质量分布对于低频
率下的贮存模量有很大影响,导致了与偏离的指数依赖关系。因此,为了更好地拟合以获取较接近于实
际的分子质量数据,采用修正的模型重新进行拟合,通常以分子质量平均值描述。基于对于材料的同一
黏弹性行为,低温与高频的影响是等效的,即“时温等效(TTS)原理”,通过测定样品的储能模量(G')和
损耗模量(G″),以30℃为参考温度,将低温下数据经平移即可获得高频区数据,以获得主曲线。然后
将主曲线与拟合数值进行对比,即可得到样品的重均分子质量和数均分子质量,以及多分散指数。
B.2 仪器、试剂与材料
B.2.1 仪器
主要仪器如下:
a) 流变仪:选用可用于低黏度流变学测试的流变仪;
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b) 冷冻干燥机;
c) 油浴锅或水浴锅;
d) 油泵减压蒸馏装置;
e) 干燥箱。
B.2.2 试剂与材料
主要试剂与材料如下:
a) 1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐(1-allyl-3-methylimidazoliumchloride,AmimCl);
b) 液氮;
c) 低黏度硅油(黏度约为10mPa·s)。
B.3 样品制备
B.3.1 样品溶解
将供试品用适当方法干燥后(含水量<5%,质量分数),按10%~15%的浓度将丝素蛋白粉末溶于
1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体中,使其充分溶解,溶解时间一般为1.5h。
注:不同分子质量的丝素蛋白样品在1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐(AmimCl)中的溶解能力有所不同。
B.3.2 冷冻干燥除水
将B.3.1制备的样品放入烧杯置于液氮中冷冻0.5h,使离子液体充分固化;再置于冷冻干燥机中充
分抽湿3d后取出,即刻密封,室温条件下解冻。
B.3.3 减压溶解
将步骤B.3.2的丝素蛋白离子液体混合物在搅拌状态下,油浴加热(温度不高于120℃),并用油泵
减压蒸馏(真空度范围:-0.06 MPa~-0.1 MPa),以除去混合物中可能残余的微量水分并消除气
泡,加热至丝素蛋白完全溶解即可。停止加热和搅拌,降温后得到均匀透明溶液。
所得丝素蛋白离子液体溶液在密封干燥的环境下室温保存,备用。
B.4 测试步骤
B.4.1 黏度测试
选择合适直径(使数据不超过流变仪的测试范围,且能获得稳定信号),如25 mm 的平行板
(Parallelplate,PP25)。测试过程中通过控温罩(H-PTD200hoodwithpeltierheating/cooling)的氮气
吹扫对测试进行保护。此外,在样品与平行板边缘滴加很薄的一层低黏度硅油(黏度约为10mPa·s),
以防止测试过程中样品对水汽的吸收。
采取稳态测试模式:试验温度为30 ℃,剪切速率由低到高进行扫描,剪切速率范围为:10-3s-1~
103s-1。记录平台曲线的黏度数值。
B.4.2 储能模量及损耗模量测试
样品放置和测试准备同B.4.1。
采用线性动态弹性测试模式,即振荡模式的应变振幅控制在10%以下,以确保在频率扫描范围
(1×102rad/s~6.81×10-2rad/s)内存储模量(G')和损耗模量(G″)为线性。
在几个不同温度下(0℃、10℃、20℃和30℃)进行频率扫描,得到不同温度下样品的储能模量和
损耗模量曲线,每次测试时间保证在1.5h以内。
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B.5 计算
B.5.1 体系成立的确认
采用AmimCl溶剂体系时,体系的Huggins参数K H 约为0.1,可判断该溶剂为丝素蛋白的良溶
剂。具体按式(B.1)~式(B.3)计算。
a) 通过测量同一温度下溶液和溶剂在不同浓度下的黏度,按式(B.1)计算比黏度。
ηsp =η -ηs
ηs …………………………(B.1)
式中:
ηsp———比黏度,单位为帕秒(Pa·s);
η ———溶液的黏度,单位为帕秒(Pa·s);
ηs ———溶剂的黏度,单位为帕秒(Pa·s)。
b) 根据浓度逼近时的极限值,按式(B.2)计算特性黏数的值。
[η]=lim c→0
ηsp
C …………………………(B.2)
式中:
[η]———特性黏数,单位为毫升每克(mL/g);
ηsp ———比黏度,单位为帕秒(Pa·s);
C ———溶液的质量浓度,单位为克每毫升(g/mL)。
c) 由溶液的黏度按式(B.3)计算Huggins参数:
ηsp =C[η]+K H(C[η])2 +A(C[η])n …………………………(B.3)
式中:
ηsp ———比黏度,单位为帕秒(Pa·s);
C ———溶液的质量浓度,单位为克每毫升(g/mL);
[η]———特性黏数,单位为分升每克(dL/g);
A ———溶剂的黏度,单位为帕秒(Pa·s);
K H ———Huggins参数。
注1:本文件验证试验证实采用AmimCl溶剂体系的Huggins参数K H 约为0.1,符合要求,能不做验证。
注2:若采用其他溶剂体系,则需要进行验证。
B.5.2 分子质量拟合计算
将所测得流变学数据以及黏度数据等导入FavorsunSmartMolFit“复向智算”生物大分子分子质
量计算商用软件,计算数均分子质量和重均分子质量。或者按式(B.4)~式(B.10)计算。
a) 储能模量和损耗模量:仪器参数设置中,应变ε=ε0sinωt,应力σ=σ0sin(ωt+δ),ω 为角频
率,δ 为应力超前相角。将应力展开为σ=σ0sinωtcosδ+σ0cosωtsinδ。应力-应变关系可以进
一步用一个和应变同相位的储能模量(G')和一个与应变相位差为π/2耗能模量(G″)表示,如
式(B.4)~式(B.6):
σ=ε0G'sinωt+ε0G″cosωt …………………………(B.4)
G'=
σ0
ε0cosδ …………………………(B.5)
G″=
σ0
ε0sinδ …………………………(B.6)
其中,储能模量G',反映施加应变后在样品中储存的能量;损耗模量G″,反映响应过程中能量
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的损耗。在动态剪切法中,流变仪可给出储能模量与损耗模量随交变剪切频率ω 的关系。储
能模量和损耗模量可从仪器测试结果中直接获得。
b) 位移因子的计算:利用测试步骤B.4.1中的不同温度下样品的黏度曲线来计算位移因子
(αT ),按式(B.7)计算:
αT =η(T)T0
η(T0)T …………………………(B.7)
式中:
αT ———位移因子;
η(T) ———不同温度下样品的黏度,单位为帕秒(Pa·s);
η(T0)———30℃下样品的黏度,单位为帕秒(Pa·s);
T ———不同测试温度,单位为开(K);
T0 ———303K。
c) 分子质量分布曲线拟合:假定溶液中分子质量为10kDa~40kDa的丝素蛋白分子的概率密
度,代入Rouse模型,按式(B.8)~式(B.10)得到拟合曲线:
G'=Σi f(i)ρRT
Mi
æ
è ç
ö
ø ÷
ΣN
p=1
ω2τ2ip
1+ω2τ2i
p
é
ë êê
ù
û úú
…………………………(B.8)
G″=Σi f(i)ρRT
Mi
æ
è ç
ö
ø ÷
ΣN
p=1
ωτip
1+ω2τ2i
p
é
ë êê
ù
û úú
…………………………(B.9)
τp = 6η0M
π2p2RT …………………………(B.10)
式中:
G' ———储能模量,单位为帕(Pa);
G″ ———损耗模量,单位为帕(Pa);
ρ ———单位体积溶液中高分子的质量,单位为克每立方厘米(g/cm3);
R ———气体常数,8.31×106 Pa·cm3/(mol·K);
T ———测试时的绝对温度,单位为开(K);
Mi ———丝素蛋白分子的分子质量,设定为10kDa~40kDa;
f(i)———分子质量为Mi 的概率密度;
η0 ———高分子溶液的黏度,单位为帕秒(Pa·s);
τp ———分子质量M 的高分子链的第p 种松弛模式的松弛时间,单位为秒(s)。
d) 分子质量计算:利用式(B.7)得到的位移因子αT ,将测试步骤B.4.2的测试结果进行平移,将低
温下测试数据经平移获得高频区数据,获得主曲线;将主曲线与步骤B.5.2c)得到的拟合曲线
进行对比,不断迭代直至主曲线与拟合曲线达到最优重合,即:在优化过程中引入动态收敛因
子,通过自适应权重策略,提高优化算法的全局寻优能力。随着迭代次数的递增,动态收敛因
子的数值逐渐减小到0,当前迭代次数达到最大迭代次数时,收敛过程终止,即为“最优重合”。
此假定值即为溶液中分子质量为10kDa~40kDa的丝素蛋白的真实概率密度。再由此概率
密度进行进一步计算,可得到丝素蛋白的数均分子质量、重均分子质量以及分子质量分布指
数,按式(B.11)、式(B.12)计算。
Mn =Σi
f(i)Mi …………………………(B.11)
M w =Σif(i)M2i
Σif(i)Mi …………………………(B.12)
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式中:
Mn ———丝素蛋白的数均分子质量,单位为千道尔顿(kDa);
f(i)———分子质量为Mi 的概率密度;
Mi ———丝素蛋白分子的初始假定分子质量,设定为10kDa~40kDa;
M w ———丝素蛋白的重均分子质量,单位为千道尔顿(kDa)。
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参 考 文 献
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控制要求
[3] GB18279.1 医疗保健产品灭菌 环氧乙烷 第1部分:医疗器械灭菌过程的开发、确认和
常规控制的要求
[4] GB18280.1 医疗保健产品灭菌 辐射 第1部分:医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规
控制要求
[5] GB/T26380 纺织品 丝绸术语
[6] 黄国瑞.茧丝学[M].北京:中国农业出版社,1994,5.
[7] InoueSS,TanakaK,ArisakaF,KimuraS,OhtomoK,MizunoS.SilkFibroinofBombyxmoriIs
Secreted,AssemblingaHighMolecularMassElementaryUnitConsistingofH-chain,L-chain,andP25,witha
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